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で、ようやっと覚え書きを書く。でもいい加減これは別コンテンツにした方がいいかな、このキーワードで飛んで来られても無駄なだけだし(笑)。
PCR
その前に:PCRで使うチップやチューブは必ず新しいものを使う。また、中にサンプルが入っているエッペンは、開ける前に必ず遠心機にかけて液を下に落とす事。
15-1.サンプルにつき、以下のモノを用意する。
・サンプル 任意量 <いつもは1μLくらいで良いかと
・dNTP(複写の材料)大体2.5mMOLくらいのやつ 5μL <サンプルの濃度により量は変化
・バッファー10倍希釈 5μL <固定
・DNAポリメラーゼ(Taq gene) 0.5μL <固定
・Primer (FandR) それぞれ1μL <サンプル濃度により濃度は変化
・滅菌水 <DNAサンプルと合わせて50μLになるようにする
(dNTP、ポリメラーゼ、バッファーは大抵は冷凍庫の中。ポリメラーゼなどは酵素なので、室温では反応が進行しやすい。
・dNTPというのは、要するにアデノシン三リン酸のこと。NにはA、T、G、Cが入る。
・DNAポリメラーゼってのはその名の通りDNAを合成する酵素。もちろん殆どの生物が持っているシロモノだが、PCRはサンプルを90度以上にするので、耐熱性の酵素が必要となる。もちろん市販されているPCR用のDNAポリメラーゼはすべて耐熱性。今回使ったTaq geneという酵素は、Thermus aquaticusから得られたもの。なんでも一番ポピュラーな酵素だとか。こいつを使った理由は、文献でプライマーと一セットになっていたから。
・プライマーについては省略。
15-2.うちの装備では0.5μLという単位でモノを取る事が難しいので(苦笑)、サンプルとその他を混ぜる前にサンプル数分作ってしまう。ちなみに、バッファーやプライマーETCの量は、
「サンプル数+ネガ(当日の方法で何も増えない事を確認するためのもの、水しか入れない)+α」
で行う。
例えばサンプルが16あったとすれば、DNAサンプルを1μLとして
dNTP 5×17=85μL
buffer 5×17=85μL
Primer 1&2 1×17=17μL(×2)
Taq 0.5×17=8.5μL
SDW 36.5×17=620.5μL
ということになる。なお、Taqは一番最後に混ぜること、なんにせよPCRにかける前は活性を抑えておきたいので、Taqおよびそいつを入れたチューブ(サンプル)は氷の中に突っ込んでおく事をオススメする。
16.PCR機にかけてすいっちおんっとな。ちなみに今回のプライマーはGCクランプのついたモノで、94度(二本鎖解離温度)で45秒、38度(アニーリング時期)で45秒、72度(DNA伸張)で1分というサイクルを30回行った。
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で、この後でPCR増幅産物を用いてDGGEに移るわけだが。
DGGEについては以前に書いたとおりなんだが、例えばゲル板の変性剤濃度勾配は、アタマからケツまで何パーセントにするのか等は経験と文献から持ってくる話になる。今回は別の人の実験と併せて、という形になるので、これが固定された方法、ではないのよ。それに多く失敗してるし(笑)。
1.泳動用のゲルを作る。使用したのはアクリルアミドゲル。知っている人は知っているが、液体及び固体の状態では、神経を侵す猛毒である。皮膚に触れても不味いので、使用の際は手袋をする事。
・37.5:1 30%アクリルアミド
アクリルアミド 泳動用 29.2g
N-N'メチレンビス(アクリルアミド) 0.8g
100mLのDWに溶かす。吸熱反応で溶けにくいので、スターラーを使うこと。アクリルアミドは冷蔵庫にて保存。ちなみにこっちで作るゲル板がメイン。
・20%C・32.5%アクリルアミド
アクリルアミド 泳動用 25.287g
N-N'メチレンビス(アクリルアミド) 6.23g
100mLのDWに溶かす。吸熱反応で更に溶けにくいので、スターラーを使うこと。こっちのゲルは、バンドをシャープに出すための「おまけ」。但し色々な意味であったほうが絶対に良い。
2.100mM Tris pH6.8を、HCLの滴下で調整して作る。ちなみに今回は0%変性ゲルと80%変性ゲルを使う(自分の見たいDNAバンドが見やすい濃度勾配範囲を使うべし)。
・0% Denature
30% アクリルアミドストック 7mL
10×TBEバッファー 3.5mL
DW 24.5mL
計 35mL
・80% Denature
30% アクリルアミドストック 7mL
10×TBEバッファー 3.5mL
尿素(Urea) 11.9g
Formamide 11.2mL
DW 適量
計 35mL
・10% APS 過硫酸アンモニウム 40mg/400μL
Forimamideは冷蔵庫内にて保存する。尿素はこれも吸熱反応をおこし、水に溶けにくい。ピペットマンあたりを使ってよく混ぜて溶かす事。
0%溶液の組成は簡単だが、80%溶液の尿素及びForimamideの量は系数的に計算されているらしい。この計算方法については詳細不明で、こっちは文献を参照してやっている。よって40%ゲル溶液は尿素5.95g、Forimamide5.6mLにすればいいわけではない、らしい。
3.ゲルを流し込むべく泳動プレート、及びゲルを送るポンプ、グラジェントメーカーをセット。予めグラジェントメーカーのゴム管の通り道が閉まっている事を確認。また、一度コム(櫛)を刺して、泳動ゲルをどこまで流すのかチェックしておく事。
4.各ゲル溶液をデシケーターに入れて脱気。
・ちなみに本来アクリルアミドは酸素存在条件下では重合を起こさず、ゲルにならないため、吸引機にて完全に脱気する事が望ましい。但し今回はサイフォンを使い、時間をかけて濃度勾配のあるゲル板を作るので、途中で流している最中にゲルになっちまうという可能性がある(実際、なった)。よってこの二つのゲル溶液はデシケーターにて20分ほど脱気する程度に止める。
・ちなみに、空気に触れるゲル板上部になる、0%ゲル溶液のみを強く脱気、という手法は0%溶液だけが先にゲル化してしまい、滅茶苦茶なゲル板ができる可能性があるため、却下(実際、なった)。
5.グラジェントメーカーの二つのチャンバー(シリンダー形の容器。二つ並んでいて底がゴム管でつながっており、そこから更に外へゴム管が繋がっている。これを流すことにより、サイフォンの原理で濃度勾配のあるゲルができるわけ)のうち、奥のチャンバーに濃いゲル溶液(80%)を入れる。空気を入れないようにグラジェントメーカーは傾け、静かに流し入れる事。
6.80%の溶液を入れたら、二つのチャンバーの間を塞いでいるネジ?を静かに開け、ゴム管の間をゲルで満たす。気泡があるとまずいわけである。
7.他方のチャンバーに0%溶液を入れ、双方にスターラーを入れておく。
8.ポンプのスイッチを入れ、双方のチャンバーに先程作ったAPSを190μL、TEMED16μLを素早く入れ、ゴム管を開けてゲルをプレートのほうへ流す。
・APS、TEMEDはどちらもアクリルアミドゲルを固化させるための鍵。濃度によりそのできるゲルの強さや、ゲル化への容易さは異なる。
・上手く流れていれば、泳動プレート内はアクリルアミドで下から満たされていく。
9.ゲルがコムに触れるか触れないかという所までせり上がってきたらポンプを止め、途中のゴム管をクリップで塞ぐ。
10.ゲルの上部(コムは外しておく)に蒸留水を静かに流しておく(ゲルと酸素が混ざるのを防ぐため)。30〜1時間待つ。
11.上部の水をプレートを傾けて捨てる(逆さまにしておいて構わないが、下にキムタオル等をしいておくこと)。これを重層と呼ぶ。
12.上部に流す濃縮ゲルを作る。ちなみに濃縮とあるが、別にゲルの濃度が濃いわけではなく、DNAをここで集めて濃縮させる役割をもつから濃縮ゲルなのである。
C20-32.5アクリルアミドストック 1.5mL
1M Tris-HCl 0.75mL
DW 15mL
13.水を切った泳動プレートに、12で作ったゲル溶液を流す。
・ゲル溶液にTEMEDを 8μL、APS10%を120μL(←先程のゲルより多い)入れ、手早く泳動プレート上部からまんべんなくゲルをピペットマンにて流し込む。大体4mLくらいかと。刺したら2時間くらい待つ
・間髪いれずゲルにコムを差し込む。
・当たり前の話だけど、アクリルアミドを扱う時は必ず手袋をし、その手袋をしたままどこでも触らない事。
14.この待ち時間を利用して、まず泳動用のTBEバッファーを10倍希釈したものを3L弱作り、電子レンジで70度弱まで温める。ついで熱湯を作り、泳動機に循環させておく。
・ちなみに今実験で使っているTBEバッファーの組成は以下のとおり(1Lあたり)。
Tris 121.14g
BoricAcid(ホウ酸) 51.32g
EDTA 3NA(2NAではない) 3.72g
DWに溶かし、1000mLにする。
15.濃縮ゲルが白くなっている事を確認し、コムを垂直に静かに引き抜く。
16.予め一定量バッファーを入れた泳動層内に泳動プレートを、内側にUの字型のプレートが来るように差し込み、固定する。後にプレートに挟まれた泳動層内を、側面の穴から漏れる程度にバッファーを入れて満たす。次いで泳動層外側をもバッファーで満たすが、この時プレートで囲まれたバッファーと外側のバッファーが混ざらないようにすること(流し込む際は混じっても構わないが、外側のバッファーは少なめにせよという意味)こうしないと電極がゲルに対して垂直になってくれない。
17.サンプル2〜3μL、ローディングバッファー1μ以下を混ぜて、サンプルを流す。この時ラダーも一緒に流せばよい(後はほぼ電気泳動と同じである)。ちなみに電圧は200V、泳動時間は1.5〜3.5時間くらい。